Analisi di perturbazione multimodale della ciclina

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 7678 (2023) Citare questo articolo

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Il controllo del ciclo cellulare è ottenuto dalle chinasi ciclina-dipendenti (CDK), motivando una ricerca approfondita sulle CDK mirate ai farmaci a piccole molecole come terapie antitumorali. Qui utilizziamo le perturbazioni combinatorie CRISPR/Cas9 per scoprire una vasta rete di interdipendenze funzionali tra CDK e fattori correlati, identificando 43 interazioni sintetico-letali e 12 sinergiche. Analizziamo le perturbazioni del CDK utilizzando RNAseq a singola cellula, per il quale sviluppiamo un nuovo quadro computazionale per quantificare con precisione gli effetti del ciclo cellulare e i diversi stati cellulari orchestrati da specifici CDK. Sebbene la distruzione a coppie di CDK4/6 sia sinteticamente letale, solo CDK6 è necessario per la normale progressione del ciclo cellulare e l'attivazione trascrizionale. CDK multipli (CDK1/7/9/12) sono letali sintetici in combinazione con PRMT5, indipendentemente dal controllo del ciclo cellulare. Un'analisi approfondita dell'espressione dell'mRNA e dei modelli di splicing fornisce molteplici linee di prova che la dipendenza da CDK-PRMT5 è dovuta a una regolazione trascrizionale aberrante che porta a una terminazione prematura. Queste interdipendenze si traducono in sinergie farmaco-farmaco, con implicazioni terapeutiche nel cancro e in altre malattie.

La regolazione e la transizione tra le fasi del ciclo cellulare vengono eseguite principalmente dalle chinasi ciclina-dipendenti (CDK) e dalle proteine ​​ciclina associate1. La famiglia CDK è ampia, con più di 20 geni codificanti proteine ​​distinti, e vi è una sostanziale incertezza riguardo alle funzioni specifiche dei singoli membri della famiglia1,2. Canonicamente, le proteine ​​CDK sono state divise in due classi funzionali: fattori che regolano il ciclo cellulare, come CDK1, 2, 4 e 6, e fattori che partecipano al controllo generale della trascrizione, come CDK7, 9 e 121 (Fig. 1a, Supplemento esteso Fig. 1). I CDK trascrizionali svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della RNA polimerasi II (RNAPII), con diverse funzioni durante l'inizio, l'allungamento e la terminazione. È stato dimostrato che CDK7,9 e 12 fosforilano direttamente RNAPII. Tuttavia, c'è ancora molta incertezza riguardo al ruolo meccanicistico e all'importanza funzionale di ciascun CDK trascrizionale. Ad esempio, è stato segnalato che CDK8 (che funziona come parte del complesso Mediator) è sia un repressore che un attivatore trascrizionale, e CDK7 ha stabilito ruoli nell'inizio, nel capping, nella pausa prossimale del promotore e nella fosforilazione di CDK93,4. CDK9 è essenziale per l'allungamento trascrizionale, con il knockdown di CDK12 che porta anche a un deterioramento globale della trascrizione, specialmente tra i geni lunghi e i geni di risposta al danno del DNA1,5,6. Tuttavia, è stato dimostrato che molti CDK funzionano sia nel ciclo cellulare che in ruoli trascrizionali, nonché in diversi altri percorsi7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Ad esempio, sia le proteine ​​del ciclo cellulare che quelle della classe trascrizionale possono attivare i regolatori epigenetici EZH2, AR, PRMT5 e PARP111,17,18,19,20 o interagire con la segnalazione cellulare proliferativa attraverso la via del fattore di crescita trasformante beta (TGFβ)21,22 . Il quadro che emerge è che i CDK governano una complessa rete di funzioni sovrapposte e sinergiche, con etichette di "ciclo cellulare" e "trascrizionale" che forniscono linee guida utili ma incomplete.

Mappatura sistematica della funzione del gene CDK nelle cellule di cancro al seno triplo negativo. (a) Le proteine ​​CDK controllano la progressione del ciclo cellulare e agiscono come regolatori trascrizionali, suscitando interesse come potenziali bersagli farmacologici (colori). (b) Schema che descrive l'approccio combinatorio di screening del fitness CRISPR/Cas9 per mappare le interazioni sintetico-letali e sinergiche del CDK. Una libreria di costrutti doppi sgRNA mirati a coppie di geni elencati in (a) è stata sintetizzata come un pool di oligonucleotidi e clonata in un vettore di sovraespressione lentivirale (in alto). Le linee cellulari TNBC sono state trasdotte con codifica virale per questa libreria e sottoposte a screening della crescita competitiva. Le risultanti fitness del costrutto doppio sgRNA sono state utilizzate per estrarre i valori di fitness di singoli geni e mappare le interazioni genetiche. (c) Schema che descrive l'approccio di fenotipizzazione trascrizionale di una singola cellula per mappare l'impatto funzionale delle perturbazioni genetiche del CDK. Una libreria di sgRNA mirata ai geni in (a) è stata clonata in un vettore di sovraespressione lentivirale compatibile con scRNA-seq e utilizzata per trasdurre linee cellulari TNBC in formato pool. Una settimana dopo la trasduzione, scRNA-seq è stato eseguito utilizzando la piattaforma 10x Chromium.